Signalni put insulina u ćelijama skeletnih mišića

Emina Sudar, Jelena Velebit, Esma R. Isenović
Institut za nuklearne nauke "Vinča" - Laboratorija za radiobiologiju i molekularnu genetiku, Beograd

Napomena: sažetak na engleskom jeziku
Note: summary in English
 

UVOD: OPŠTE OSOBINE INSULINA

Insulin (INS) je hormon endokrinog pankreasa i jedan je od najznačajnijih proteina kičmenjaka. Povećana koncentracija glukoze (Glu) u krvi stimuliše β ćelije pankreasa i dovodi do sekrecije INS egzocitozom.
U krvi INS se nalazi u slobodnom obliku, odnosno ne postoje specifični proteini plazme za koje se vezuje. Usled toga, njegov poluživot je kratak (oko 5 min.) [1].
INS se vezuje za svoj stereospecifični receptor- receptor za insulin (IR) koji se nalazi na plazma membrani velikog broja ćelija. Najveća koncentracija IR nalazi se na ćelijama jetre, mišića, masnom tkivu i limfocitima [1].
Pre svega, INS povećava transport Glu kroz membrane ćelija u većini tkiva, a naročito u poprečnoprugastim mišićima, masnom tkivu i glatkim mišićima [2]. INS favorizuje transport Glu difuzijom. Kada koncentracija Glu u ćeliji premaši koncentraciju Glu u vanćelijskoj tečnosti, unos Glu prestaje. U ćelijama se vrši fosforilacija Glu tako da ne ostaje gotovo nimalo slobodne Glu, što omogućava unos novih količina u ćeliju. Osim na transport Glu, deluje i na transport drugih monosaharida (ksiloza, arabinoza, galaktoza) [1].
U nedostatku INS, transport Glu u većini ćelija smanjen je za jednu četvrtinu normalne vrednosti, te tada tkiva u energetske svrhe koriste, umesto Glu, masti i proteine. Izuzetak su mozak i srce(1).
INS utiče i na povećanje količine glikogena u skeletnim mišićima, koži, žlezdama i dr. Na sličan način deluje i na jetru, ali se početni efekat razlikuje od efekta u drugim tkivima. Na početku delovanja INS povećava otpuštanje Glu iz hepatocita u krv, čime se količina glikogena u jetri smanjuje. Deset časova od početka infuzije Glu, INS usmerava transport Glu u suprotnom pravcu, tj. Glu tada ulazi u ćelije jetre i kao posledica toga dolazi do povećanja količine glikogena u jetri.
Indirektno INS stimuliše lipogenezu, omogućavajući nastanak prekursora za sintezu masnih kiselina, ali i direktno delujući na aktivaciju enzima koji učestvuju u sintezi masnih kiselina i holesterola (1).
Na metabolizam belančevina INS deluje indirektno preko metabolizma ugljenih hidrata, a u manjoj meri time što povećava transport belančevina kroz ćelijske membrane. Povećavajući metabolizam ugljenih hidrata, INS, utiče na racionalno korišćenje proteina (2). On smanjuje katabolizam proteina u tkivima i zato dolazi do njihovog intenzivnijeg anabolizma, čime INS posredno favorizuje rast i neophodan je za dejstvo hormona rasta (1).
Takođe, INS, povećava transport fosfata i kalijuma u ćelije. Smatra se da favorizuje transport fosfata tako što se u ćelijama stvara veća količina glikozofosfata, čime se smanjuje koncentracija fosfatnih jona u ćelijama, a to povoljno deluje na transport fosfata u ćelije. Glavna mesta degradacije INS jesu jetra i bubrezi.

RECEPTOR ZA INSULIN

Receptor za insulin (IR) pripada grupi membranskih receptora koji poseduju tirozin kinaznu aktivnost. Po strukturi je heterotetramerni glikoprotein koji čine dve ekstraćelijske α i dve transmembranske β subjedinice koje su najvećim delom locirane unutar ćelije α subjedinice, kao i α i β subjedinice međusobno, povezane su disulfidnim vezama [2].
α subjedinica IR predstavlja njegovu regulatornu, ligand vezujuću komponentu i poseduje region bogat cisteinom, koji je bitan za vezivanje INS. Pri vezivanju liganda dolazi do konformacione promene koja omogućava proces autofosforilacije β subjedinice [2, 3].
β subjedinica pretstavlja katalitičku subjedinicu IR i po funkciji spada u tirozin (Tyr) specifične protein kinaze. Ekstraćelijskim delom ostvaruje interakciju sa α subjedinicom, transmembranski deo učvršćuje receptor u ćelijskoj membrani i učestvuje u njegovoj internalizaciji nakon vezivanja hormona, a intraćelijski region uz membranu poseduje regulatornu funkciju, jer sadrži Tyr ostatak na položaju 960 koji se fosforiliše i bitan je za prepoznavanje ćelijskih supstrata. U regulatornom regionu β subjedinice nalazi se i lizin na položaju 1018 koji učestvuje u vezivanju ATP-a, kao i tri Tyr ostatka na položajima 1146, 1150, 1151, koja pretstavljaju mesta autofosforilacije IR. Fosforilacija ovih aminokiselina dovodi do konformacione promene koja omogućava pristup ATP-u i ćelijskim supstratima koje receptor fosforiliše. C-terminalni region β subjedinice receptora sadrži dva Tyr ostatka (1316 i 1322) koje IR autofosforiliše i serin/treonin(Ser/Thr) ostatke (1293, 1294, 1334), čija afosforilisanost reguliše kinaznu aktivnost receptora. Nakon autofosforilacije (bar šest mesta), β subjedinica je sposobna da fosoriliše i druge ćelijske supstrate [4].

INSULINSKI SIGNALNI PUT U SKELETNIM MIŠIĆIMA

Skeletni mišicći (SM) preuzimaju oko 85% ukupne Glu pri insulinskoj stimulaciji [5,6] i Glu se u njih inkorporira i skladišti u vidu glikogena [7].
Preuzimanje Glu u SM uglavnom zavisi od INS, mada može biti stimulisano i nezavisno od INS i njegovog receptora, primenom fizičkog napora ili električnih stimulacija[3].
Glu u ćelije ne ulazi procesom proste difuzije već uz pomoć proteina nosača, koji olakšavaju transport Glu kroz ćelijsku membranu. Do sada je iz sisarskih tkiva klonirano pet tipova proteina koji olakšavaju transport Glu i identifikovani su kao glukozni transporteri (GLUT) od GLUT1 do GLUT5 (3). Iako su sličnih struktura, svaki član GLUT familije ima specifičnu distribuciju po tkivima i specifične regulatorne mehanizme da bi se zadovoljile različite potrebe različitih tkiva [3].
U ćelijama SM, imunocitohemijskim metodama, lokalizovani su GLUT1 koji je prisutan u većini tkiva, uključujući mozak i eritrocite i GLUT4 koji je prisutan i u adipoznom tkivu [3, 8].
Ćelijska kultura humanih SM ćelija omogućuje odgovarajući model sistem u kome se mogu proučavati molekularni mehanizmi insulinskog signalnog puta [9]. Tako je primenom ove metode otkriveno da u mioblastima i miotubama u kulturi dolazi do znatno manje ekspresije GLUT4, a da je znatno veća ekspresija GLUT1 nego u intaktnim SM i interesantno je da se ekspresija GLUT1 smanjivala sa diferencijacijom mišićnih ćelija u kulturi, a paralelno sa redukcijom ekspresije GLUT1, redukovalo se i preuzimanje Glu, i to kako pri bazalnim uslovima tako i pri stimulaciji INS [8,9].
U bazalnim uslovima GLUT su u ćeliji u vezikulama. U odgovoru na stimulaciju INS dolazi do egzocitoze vezikula sa GLUT i GLUT1 i GLUT4 translociraju se na površinu membrane mišićne ćelije. Poremećaji u mehanizmima koji su odgovorni za ovu translokaciju, vode insulinskoj rezistenciji. Međutim, količina translociranog GLUT4 pri stimulaciji INS je mnogo veća nego količina translociranog GLUT1. U SM ćelijama 90% Glu transporta je posredovano GLUT4-om [10]. Čak je pokazano da u humanim i mišićnim ćelijama pacova, transport Glu pri stimulaciji insulinom može u potpunosti biti zadovoljen translokacijom samo GLUT4 na ćelijsku membranu [3]. GLUT4 je u mogućnosti da uveća transport Glu pri stimulaciji INS od 10 do 40 puta [10]. Nasuprot tome, uz pomoć GLUT1 ostvaruje se manji deo transporta Glu u mišićnim ćelijama, smatra se INS nesenzitivnim, manjeg je afiniteta za Glu i vrši transport Glu u bazalnim uslovima [10]. Dakle, INS stimulisano preuzimanje Glu u mišićnim ćelijama posredovano je translokacijom GLUT4 na površinu ćelijske membrane, dok GLUT1 posreduje u preuzimanju Glu u mišićne ćelije pri bazalnim uslovima [8].
Signalni put iniciran INS, a koji vodi do translokacije GLUT4 na ćelijsku membranu, uključuje interakcije autofosforilisanog IR (preko Tyr960) sa fosfotirozin vezujućim domenima (PTB), kao i za tzv. PH domenima ("pleckstrin homology") supstrata. PTB domeni predstavljaju kratke oligopeptidne sekvence u strukturi proteina koje prepoznaju i vezuju se za regione u proteinu u kojima se nalazi fosforilisani Tyr. PH domeni takođe su kratke oligopeptidne sekvence u proteinima koje su značajne za ćelijsku lokalizaciju proteina, a ime im potiče od plekstrina, molekula u kome su otkrivene [4]. Dosadašnja istraživanja su pokazala da već na nivou IR dolazi do divergencije INS signala. Identifikovano je više ćelijskih proteina koje IR fosforiliše pri stimulaciji INS, te je ta grupa proteina dobila ime supstrati insulinskog receptora (IRS) [7].
U mišićnim ćelijama IR fosforiliše IRS-1, inače prvi otkriveni IRS i do sada detaljno okarakterisan. Poseduje preko 20 karakterističnih sekvenci sa Tyr koji može biti fosforilisan i više od 30 Ser/Thr sekvenci čija fosforilacija igra ulogu u regulaciji funkcije IRS-1. IRS-1 protein-protein interakcijom prenosi signal na sledeće učesnike signalne mreže. IRS-1 funkcioniše kao ”docking” protein, interagujući uglavnom preko svojih regiona koji sadrže fosforilisane Tyr sa SH2 proteinima [7]. SH2 proteini su dobili ime po SH2 domenima ("src-homology 2 domain") koje sadrže i koji su otkriveni kod src proteina i koji interagju sa regionima proteina u kojima se nalaze fosforilisani Tyr. Regulatorna subjedinica fosfatidil inozitol 3 kinaze (PI-3K) je SH2 protein [4].
Tyr fosforilisani IRS-1 vezuje se za p85α regulatornu subjedinicu PI-3K i p110 katalitička subjedinica biva aktivirana [11]. Ona fosforiliše inozitolne molekule na položaju 3 i funkcioniše kao Ser kinaza. Fosfatidil inozitolni (PI) molekuli se vezuju za protein kinazu B (PKB) i aktiviraju je fosforilacijom na bar dva mesta (Thr i Ser) [7]. Aktivacija PKB je, po svemu sudeći, esencijalna za efikasan transport Glu pri insulinskoj stimulaciji. Jednom aktivirana PKB fosforiliše GLUT4 i kinazu 3 glikogen sintaze (GSK-3) i inaktivira je. Inaktivacija GSK-3 potpomaže aktivaciju glikogen sintaze i povećava sintezu glikogena (polimer glukoze, polisaharid). [12] Sinteza glikogena pretstavlja primarni put anaerobnog metabolizma glukoze. [12]
Regulacija aktivnosti glikogen sintaze je veoma kompleksna i uključuje fosforilaciju devet amino kiselina različitim kinazama i defosforilaciju proteinskom fosfatazom-1 (PP-1). Povećana koncentracija glikogena smanjuje aktivnost glikogen sintaze kako u prisustvu tako i u odsustvu INS, jer je koncentracija glikogena u SM ograničena i postoji mehanizam povratne sprege, a takodje, koncentracija glikogena utiče i na na preuzimanje Glu u SM. [7]

INSULINSKA REZISTENCIJA I DIABETES MELLITUS TIP 2

Periferna insulinska resistencija koja uključuje poremećaje transporta Glu u adipocitima i SM, ključni je faktor u patogenezi Diabetesa Mellitusa tipa 2 (DMT2). [6]
DMT2 ili INS nezavisan oblik šećerne bolesti, je bolest koja uglavnom nastaje sadejstvom genetičkih faktora i faktora spoljašnje sredine, mada u nekim slučajevima, faktori spoljašnje sredine kao što su neaktivnost, gojaznost i stres više doprinose nastanku oboljenja [5]. DMT2 je prisutan u oko 90% svih dijabetičara i karakteriše ga periferna insulinska rezistencija praćena deficitom u sekreciji INS. Da bi se razvio DMT2 oba poremećaja moraju biti prisutna. [12]

Šema br. 1: Aktivacija glikogen sintaze posredovana insulinom: Vezivanje insulina za njegov receptor (IR), dovodi do aktivacije fosfokinaze B (PKB). Supstrat PKB je kinaza 3 glikogen sintaze (GSK-3K) koja biva inhibirana, čime je omogućena aktivnost glikogen sintaze i sinteza glikogena.

Normalno, INS se vezuje za IR na efektornim ćelijama, što dovodi do niza reakcija u ćeliji uz pomoć kojih se vrši transport Glu u ćeliju i njeno metabolisanje. Insulinska rezistencija je nesposobnost da periferna ciljna tkiva odgovore na odgovarajući način na fiziološku koncentraciju INS prisutnu u cirkulaciji, stoga po definiciji insulinska rezistencija je defekt u signalnoj transdukciji. [2] Da bi se postigle fiziološke vrednosti glikemije, pankreas pojačano luči INS te dolazi do kompenzacije insulinske rezistencije. Međutim, nakon perioda kompenzovane insulinske rezistencije ipak dolazi do oštećenja tolerancije Glu iako se koncentracija INS povećava sa povećanjem insulinske rezistencije. Konačno, dolazi do poremećaja funkcije β ćelija i one ne uspevaju da luče dovoljno INS. [12]
S obzirom na to da SM preuzimaju najveći deo ukupne Glu, insulinska rezistencija u SM od velikog je značaja za razvoj DMT2 i može se javiti na tri nivoa: na nivou transporta Glu, heksokinaze tj. fosforilacije Glu i na nivou sinteze glikogena. [5,12]
S obzirom na to da je transport Glu jedan od prvih ograničavajućih koraka u metabolizmu Glu, a nishodno je regulisan u DMT2-u, gen za GLUT4 bio je kandidat za prosvetljavanje molekularnih mehanizama uključenih u perifernu insulinsku rezistenciju, međutim nije pronađena korelacija između insulinske rezistencije i snižene ekspresije GLUT4 u DMT2, pošto je snižena ekspresija GLUT4 prisutna i u nekih zdravih osoba, ali primećen je poremećaj u transportu GLUT4 na površinu ćeliske membrane mišićne ćelije pri insulinskoj stimulaciji. [5]
U pacijenata sa DMT2 poremećen transport Glu pri insulinskoj stimulaciji u SM udružen je sa smanjenom količinom proteina IR i IRS-1, smanjenom fosforilacijom Tyr u IR i IRS-1 i redukovanom aktivnošću PI-3K. Redukovana Tyr kinazna aktivnost IR i redukovana fosforilacija IRS-1 nije povezana sa promenama u količini proteina IRS-1, pošto je ekspresija IRS-1 ista u pacijenata sa DMT2 i zdravih osoba. [5]
Identifikovano je nekoliko polimorfizama u genu za IRS-1 i pronađeno je da su prisutni kako u pacijenata sa DMT2, tako i u zdravih osoba, te se za sada to ne smatra bitnim za nastanak DMT2. [5]
S obzirom na to da se smatra da je aktivacija PI-3K ključni korak u preuzimanju Glu pri stimulaciji INS, rađeni su eksperimenti u kojima se pratila aktivacija PI-3K pri stimulaciji INS u zdravih osoba i osoba sa DMT2 i utvrđeno je da do povećane aktivnosti PI-3K pod uticajem INS u DMT2 pacijenata ne dolazi. [5] Osim toga, u ovih pacijenata redukovana je i aktivnost PKB [11]. Ipak, snižena aktivnost PI-3K pri stimulaciji INS ne mora nužno da dovede i do redukcije u aktivciji PKB. Nađeno je da INS dovodi do normalne fosforilace PKB u SM koji su rezistentni na INS, uprkos u isto vreme smanjenju aktivnosti PI-3K [11].
U deksametazonom indukovanoj insulinskoj rezistenciji, iako ne dolazi do poremećaja u fosforilaciji IR pri insulinskoj stimulaciji, dolazi do inhibicije asocijacije IRS-1 i PI-3K i snižene fosforilacije PKB i GSK-3 i kompletno se blokira uticaj INS na defosforilaciju i aktivaciju glikogen sintaze, a da pri tome nema uticaja na ekspresiju ovih proteina, pri čemu farmakološki inhibirana GSK-3 u deksametazonom izazvanoj insulinskoj rezistenciji dovodi do povećanja u sintezi glikogena, ali pri tome nema poboljšanja u INS stimulisanom transportu Glu [11].
Transport Glu je osnovni korak u preuzimanju Glu u SM pri insulinskoj stimulaciji i ograničavajući je faktor za celokupan metabolizam Glu u organizmu. Da bi se utvrdila razlika između poremećaja u transportu Glu i poremećaja u delovanju heksokinaze II u sintezi glikogena u mišićima pri insulinskoj rezistenciji, meren je nivo slobodne Glu u ćeliji, jer po transportu Glu u ćeliju ona biva fosforilisana uz pomoć heksokinaze u glukozo-6-fosfat. Defekt u heksokinazi II anticipiran je pri hiperinsulinemiji ako je više povišen nivo slobodne Glu u ćeliji u odnosu na povećanje u nivou glukozo-6’fosfata, dok se poremećaj u transportu Glu pripisivao ako je odnos povećanja nivoa bio proporcionalan. [13]. Nekoliko grupa autora kloniralo je i okarakterisalo gen za heksokinazu II i došli su do zaključka da mutacija u genu za heksokinazu II ne doprinosi razvoju insulinske rezistencije i DMT2 [5].
U pacijenata sa DMT2 INS stimulisano povećanje slobodne Glu je bilo smanjeno ukazujući na to da je primarni defekt u transportu Glu pri redukovanoj sintezi glikogena [13].

ZAKLJUČAK

SM preuzimaju oko 85% ukupne Glu pri insulinskoj stimulaciji, te insulinska rezistencija u SM umnogome doprinosi postprandijalnoj hiperglikemiji koja je glavni patogeni faktor mnogih kasnijih komplikacija u pacijenata sa DMT2 i može biti na nivou transporta Glu, njene fosforilacije i sinteze glikogena.
Transport Glu je osnovni korak u preuzimanju Glu u SM pri insulinskoj stimulaciji i ograničavajući je faktor za celokupan metabolizam Glu u organizmu.
U insulin rezistentnim stanjima, mnogi poremećaji u insulinskoj signalnoj mreži su okarakterisani, iako još uvek nije jasno koji od tih poremećaja je primarni.
S obzirom na to, mehanizmi koji leže u osnovi insulinskog signalnog puta u SM, predstavljaju važno polje istraživanja pri proučavanju patofiziologije DMT2 i insulinske rezistencije.
 

LITERATURA

1. Petrović,V. Cvijić,G. Endokrinologija. 1. izdanje, Beograd: Zavod za udžbenike i nastavna sredstva; 1997.
2. Pessin JE, Saltiel AR. Signaling pathways in insulin action: molecular targets of insulin resistance. The Jurnal of clinical Investigations 2000; Volume 106, Number 2: 165-169.
3. Ryder JW, Chibalin AV, Zierath JR. Intracellular mechanisms underlying increases in glucose uptake in response to insulin or exercise in skeletal muscle. Acta Phisiol Scand 2001; 171, 249-257.
4. Korićanac G. Osobine i sinteza insulinskih receptora pod delovanjem glukokortikoida kod pacova različite starosti. Doktorska disertacija, Biološki fakultet, Beograd, 2000.
5. Zierath JR, Krook A, Wallberg-Henriksson H. Insulin action in skeletal muscle from patients with NIDDM. Mol.and Cellular Biochemistry 1998; 182: 153-160.
6. Chowdhury HH, Jovsek M, Kreft M, Mars T, Zorec R , Grubic Z. Insulin induced exocytosis in single, in vitro innervated human muscle fibres: a new approach. Pflugers Arch- Eur J Physiol 2005; 450: 131-135.
7. Jensen J, Jebens E, Brennesvik OE, Ruzzin J, Soos MA, Engebretsen EML et al. Muscle glycogen inharmoniously regulates glycogen synthase activity, glucose uptake and proximal insulin signaling. AJP-Endocrinology and Metabilism 2006; 290: 154-162.
8. Al-Khalili L, Cartee GD, Krook A. RNA interference-mediated reduction in GLUT1 inhibits serum- induced glucose transport in primary human skeletal muscle cells. Biochem and Biophysical Research Communications 2003; 307: 127-132.
9. Al-Khalili L, Chibalin AV, Kannisto K, Zhang BB, Permert J, Holman GD et al. Insulin action in cultured human skeletal muscle cells during differentiation: assessment of cell surface GLUT4 and GLUT1 content. Cell. Mol. Life Sci. 2003; 60: 991-998.
10. Brennan CL, Hoening M, Ferguson DC. GLUT4 but not GLUT1 expression decreases early in the development of feline obesity. Domestic Animal Endocrinology 2004; 26: 291-301.
11. Ruzin J, Wagman AS, Jensen J. Glucocorticoid-induced insulin resistance in skeletal muscles: defects in insulin signaling and effects of a selective glycogen synthase kinase-3 inhibitor. Diabetologia 2005; 48: 2119-2130.
12. Peterson KF, Schuman GI. Pathogenesis of skeletal muscle insulin resistance in type 2 diabetes mellitus. The American Journal of Cardiology 2002; 90: 11-18.
13. Courtney HC, Olefskiy JM. Endocrinology. Insulin resistance. Landes Bioscience, 2003. www.eurekah.com