ISSN 035-2899, 38(2013) br.1 p.30-34

Tatjana Sokolović (1), Milica Lazović (2), Dušan Đurić (3), Vlada Cekić (4)
(1) PLIVA TEVA, BEOGRAD, (2) INSTITUT ZE REHABILITACIJU BEOGRAD, (4) INTEGRISANE STUDIJE FARMACIJE, MEDICINSKI FAKULTET U KRAGUJEVCU, (4) HEMOFARM AD, BEOGRAD


 

UVOD

Ćelijska smrt predstavlja proces koji je suprotan od mitoze, ali ono što im je zajedničko, jeste kompleksnost koja podrazumeva i složenost procesa njihove regulacije. Da li će ćelija ući u proces mitoze ili proliferacije ili u proces programirane ćelijske smrti, zavisi prvenstveno od prirode signala, tačnije da li će delovati faktori mitoze ili faktori smrti.
Apoptoza je programirana ćelijska smrt koja se odlikuje pored obaveznih funkcionalnih promena i specifičnim morfološkim promenama koje su u korelaciji sa prethodnim. Specifične morfološke promene dešavaju se u jedru i citoplazmi kroz proces kondenzacije hromatina kao i povećanje gustine jedra i citoplazme i konačne fragmentacije ćelija u apoptotična telašca, pri čemu je intergitet plazma membrane očuvan, što je jedna od razlika u odnosu na smrt ćelije procesom nekroze. Ono što apopoptozu razlikuje od nekroze, jeste očuvanost mitohondrija, koje ne bubre i ne gube svoju funkciju, tačnije funkcionalno su aktivne u apoptotičnim telašcima. Jednom inicirana, programirana smrt ćelije (PCD) uslovljava pokretanje kaskade biohemijskih reakcija čiji je krajnji rezultat degradacija i fra-gmentacija genomske DNK. Glavni nosioci u biohemijskim reakcijama su proteaze (kaspaze) i nukleaze.
U patologiji savremenog čoveka posebno mesto zauzimaju neoplastična oboljenja kod kojih zbog nemogućnosti kauzalne terapije značajnu primenu ima hemioterapija. Mnoge studije ukazuju na antiproliferativne efekte aktivnih principa nekih biljaka iz grupe flavonoida, flavona, hiperozida i drugih. Jedan od aktivnih principa biljaka, čija su modulatorna dejstva na ćelijsku proliferaciju predmet značajnog broja u in vitro i in vivo studija je hipericin.

Hipericin
Hypericum perforatum L. (kantarion, bogorodična trava, gospino zelje, St. John’s Wort) pripada familiji Hypericacae. Hypericum se odnosi na lekovitost biljke, dok perforatum ukazuje na čitav niz svetlih, prozirnih tačaka koje se uočavaju na listovima i predstavljalju žlezde sa etarskim uljem. Za mnoge sistemske efekte kantariona odgovoran je hipericin.
Ekstrakt kanatariona se danas koristi kao antidepresiv, ali i kod psihovegetativnih poremećaja, anksioznosti i uznemirenosti. Dokazano je da hipericin ovo dejstvo ostvaruje inhibicijom enzima monoaminooksidaze: monoaminooksidaze A (MAO A) i monoaminooksidaze B (MAOB), a ispitivanja in vitro na mitohondrijama izolovanim iz mozga pacova pokazala su da je ovo dejstvo posebno izraženo prema MAOB [1]. Kao posledica nagomilavanja biogenih amina u velikom mozgu nastaje povećanje psihomotorne aktivnosti i smanjenje depresivnih misaonih sadržaja, a posle većih doza hipomanija, što je u eksperimentalnim studijama sa hipericinom na životinjama i potvrđeno [2].

Apoptoza – programirana ćelijska smrt
Život i rast ćelija je interakcija kompleksnih procesa koji uključuju ćelisku duplikaciju, ćelisku smrt, tj. procese koji su precizno regulisani. Ćelije ulaze u ćelijski ciklus i sledstvenu sintezu DNK kao reakciju na eksterne fak-tore, uključujuči faktore rasta i faktore adhezije. Tranzicija ćelije kroz faze ćelijskog ciklusa je regulisana aktiv-nošću ciklin-zavisnih kinaza (cdk) i njihovih inhibitora (cki). Radovima Kerra i saradnika 1971. i 1972. se po prvi put obelodanjuje postojanje sasvim različitog oblika smrti ćelije, nazvanog „programirana smrt“ ili „samo-ubistvo ćelije“, koji bi odgovarao fiziološkoj smrti i koji je dobio naziv apoptoza, za razliku od nekroze, koja predstavlja patološku smrt [3].
Apoptoza je proces koji se pokreće uticajima znatno manjeg intenziteta nego kod nekroze, ali dovoljnim da posredstvom indukcije „signala smrti“ sama ćelija pokrene seriju kaskadnih reakcija koje vode njenom uništenju [4]. Pri tome u procesu učestvuje svaka ćelija ponaosob, i to aktivnim procesom, zbog čega je uveden naziv “samoubistvo ćelije“. Izraz apoptoza i programirana ćelijska smrt se često upotrebljavaju kao sinonimi, premda apoptoza podrazumeva i programiranu smrt ćelije, ali i određene morfološke promene, dok svaka pro-gramirana smrt ne mora imati obeležje apoptoze [5].

Funkcionalne promene u apoptozi
Svaka ćelija koja je započela apoptozu prolazi kroz tri funkcionalno različite faze: fazu inicijacije, fazu aktivacije (efektorna faza) i fazu degradacije. Pojedini istraživači apoptozi pridodaju i fazu fagocitoze kao poslednju, sve do definitivne degradacije makromolekula i struktura ovako umrle ćelije [6]. Faza inicijacije započinje delovanjem apoptotičkih signala okoline - fizičkih faktora (toplota, radijacija), hemijskih faktora (toksini, neki lekovi) i bioloških faktora (virusi, bakterijski toksini, onkogeni, slobodni radikali, supresori tumora). Informacija se potom prenosi u ćeliju, tako što se serijom enzimskih reakcija, aktivira unutrašnji genetski kodirani program smrti. U inhibitore apoptoze spadaju fiziološki i farmakološki agensi i vitalni geni. Najznačajniji među njima su: faktori rasta, ekstracelularni matriks, CD-40, androgeni i estrogeni, Zn2+, promotori tumora i inhibitori cistein-proteaze [7]. S obzirom na to da je farmakološki uticaj moguć u oba smera, tj. u indukciji i inhibiciji apoptoze, trasirane su nove smernice u sintezi lekova [8].

Morfološke promene u apoptozi
Osnovne morfološke promene u toku apoptoze dešavaju se u jedru i citoplazmi. One se odvijaju u tri faze. U prvoj fazi dolazi do kondenzacije hromatina u polumesečasta telašca na periferiji jedra, dezintegracije jedra i redukcije njegove veličine. Elektronmikrosopski su potvrđene sledeće pro-mene: sakupljanje ukupnog ćeliskog volumena, porast gustine ćelije, zbijanje ćelijskih organela i širenje EPR-a, dok su mitohondrije ostale uglavnom morfološki nepromenjene.
U drugoj fazi dolazi do bubrenja i deobe i jedra i citoplazme i stvaranja mnogih apoptotičkih telašca. Ona mogu biti preuzeta na površini epitela ili fagocitovana od strane susednih ćelija ili makrofaga. U trećoj fazi dolazi do progresivne degeneracije preostalog jedra i citoplazmatskih struktura [5].

Genska kontrola apoptoze
U kontroli apoptoze učestvuje veći broj gena. Najbolje proučeni model je kontrola ovog procesa kod crva (nematodes) Caenorabdites elegans, zbog čega su ovi geni nazvani cedgeni [9].
Do sada je poznato ukupno 13 gena, koji kod ovog crva vrše modulaciju programirane smrti (slika). Ostali geni determišu proces fagocitoze i, konačno, degradacije DNK [10]. Potvrđeno je da je ced-3 gen sličan interleukin 1β konvertujućem enzimu (ICE), koji može izazvati apoptozu u kulturi fibroblasta [11]. Kod sisara su poznate inetrakcije mnogih poznatih faktora sa analognom funkcijom-humani Bcl-2 blokira apoptozu Caenorrabditid elegansa, te predstavlja analog gena ced-9. Inhibiciju apoptoze vrše i drugi proteini iz iste grupe-Bcl-XL i Mcl—1, c-myc i p53 su, pak, antionkogeni koji mogu stimulisati apoptozu [12], ali i uvesti u reparaciju, što govori u prilog jedinstvu procesa proliferacije i destrukcije. Antiapoptično dejstvo imaju i ostali članovi porodice onko-gena Bcl-2, Mcl-1, NR-13, Al, Bcl-w, Bax, Bak, s tim da poslednja dva takođe mogu delovati i proapoptotički [12].

Enzimi koji učestvuju u apoptozi
Jednom inicirana programirana smrt ćelije (PCD) uslovljava pokretanje kaskade biohemijskih reakcija, čiji je kranji rezultat ireverzibilna degradacija i fragmentacija genomske DNK. Glavni nosioci u biohemijskim reakci-jama su proteaze i nukleaze koje katalizuju reakcije koje imaju kritičnu ulogu za ulazak ćelije u PCD [13].
Biohemijski put u toku ćelijske smrti ostvaruje se kroz dva procesa: spoljašnjeg „extrising“ i unutrašnjeg „intri-sing“, koji deluju preko receptora smrti ili procesa koji su locirani u mitohondrijama. Apoptoza moze biti indukovana smanjenjem prisustva antiapoptotičnih stimulatora, gubitka normalne strukture mitohondrija i oslobađanjem citohroma c ili ligand vezujućih receptora smrti. Na ovaj način dolazi do aktivacije efektornih kaspaza u mitohondrijama [13].
Bez obzira na specifičnost stimulusa apoptoze, ona uvek ima za posledicu aktivaciju kaspaza, koje čine familiju cistein proteaza, a koje u normalnim uslovima u ćeliji postoje u obliku inaktivnih prekursora [13]. Njihovom aktivacijom u apoptozi dolazi do selektivnog cepanja velikog broja target proteina, pri čemu imaju važnu ulogu u inicijaciji efektorne faze u kojoj su glavni medijatori. Do sada je potvrđeno 14 kaspaza kod sisara koje su podeljene u tri grupe [14]. Prvu grupu čine kaspaze odgovorne za produkciju citokina, dok kaspaze druge i treće grupe imaju direktnu ulogu u apoptozi. U celoj familiji izdvajaju se kaspaza 8, 9 i 10 kao inicijalne, a kaspaze 3 i 6 kao efektorne kaspaze. Aktivacijom efektornih kaspaza dolazi do cepanja citozolarnih i jedarnih supstanci, u čemu aktivnu ulogu imaju i enzimi odgovorni za razgradnju DNK [14]
Upravo razgradnja nuklearne DNK u nukleozomalnim jedinicama je jedna od najznačajnijih biohemij-skih karakteristika ćelijske smrti apoptozom. Otkriveno je i opisano nekoliko različitih molekula koji mogu da imaju endonukleaznu aktivnost. Nukleaza koje učestvuju u razgradnji DNK su DN-aza I konstitutivno ispoljavaju svoju aktivnost u tkivima koja su sa predispozicijom za apoptozu. DN-aze II, katjon nezavisne, sa optimalnom pH 5 definisane kao kisele DN-aze. Jedinstveno je prihvaćeno mišljenje da kaspaze i kaspaza zavisne nuklaze imaju ključnu ulogu u apoptozi. U svemu tome je interesentna hipoteza o univerzalnoj ulozi nekih proteina u apoptozi koji vrše dvojaku funkciju - inhibiraju proteolizu i štite normalnu strukturu i funkciju ćelije ili, sa druge strane, potpomažu cepanje proteina i hromatina u apoptozi, u uslovima kada se oslobode inhibitora [14].

Hipericin i ćelijska proliferacija
Antiproliferativna svojstva i citotoksičnost hipericina dokazana su na mnogim ćelijskim linijama [15,16].
Vandenbogaerde i saradnici (1997.) dokazali su da je citotoksičnost hipericina na HeLa ćelijama u nanomolarnoj koncentaraciji u direktnoj korelaciji sa fotosenzibilizacijom. To je reprezentativni primer fotocitotoksičnosti, a mehanizam kojim hipericin ostvaruje ovo dejstvo je inhibicija protein kinaze C [17].
Novija istraživanja sve više potvrđuju značajno mesto hipericina u apoptozi, čime se otvara mogućnost njegove primene u terapiji nekih tumora [18, 19]. Fox i saradnici ispitivali su antiproliferativnu aktivnost fotoaktivnog hipericina na normalne, transformisane i maligne T-limfocite, kao i mogućnosti njegove primene u terapiji limfoproliferativnih bolesti kože [20]. Dokazano je da je indukcija apoptoze jedan od mehanizama kojim hipericin inhibira proliferaciju T-ćelija. Potvrđen je dozno zavisni inhibitorni efekat na rast ćelija pitui-tarnog adenoma, što on ostvaruje inhibicijom protein kinaze C (PKC) [21]. Weller i saradnici (1997.) su potvrdili da hipericin indukuje apoptozu na sedam ćelijskih linija humanog malignog glioma, uz dozno vremensku zavisnost i fotostimulaciju [15]. Međutim, ova indukcija apoptoze isključuje kao uzrok inhibiciju sinteze RNK i proteina, a citotoksičnost hipericina ne dovodi u korelaciju sa inhibicijom protein kinaze C, niti indukuje faktor tumorske nekroze α (TNF α) i CD 95 liganda.
U prilog jasnom učešću enzima odgovornih za razgradnju nukleinskih kiselina u procesu degradacije i sledstve-nog usmerenja ćelije u programiranu smrt, ukazuju rezultati istraživanja mo-dulatorni efekti hipericina na aktivnost enzima odgovornih za metabolizam nukleinskih kiselina, DNA-ze i RNA-ze, u in vivo uslovima u dozno-zavisnom dizajnu u uslovima nestimulisane i stimulisane proliferacije na modelu 2/3 resekcije jetre [22]. Tačnije, u uslovima nestimulisane proliferacije zabeležen je porast aktivnosti DNA-ze I i RNA-ze I koji je u dinamičkom odnosu sa količinom DNK i RNK [22]. Aktivnost kisele DNA-ze II prati aktivnost alkalne DNA-ze I pri dozi koja je terapijska za ispitivani preparat čiji je aktivni princip hipericin, dok je smanjena aktivnost ovog enzima u značajno višim dozama od terapijske (10 puta) rezultat pomeranja pH ćelije u pravcu alkalizacije uslovljene uticajem hipericina. U uslovima stimulisane proliferacije višestruko aktivacija DNA-za I aktivnosti ima signifikantan upliv na količinu novosintetisane DNK [22]. Značajno manja aktivnost DNA-ze Ii u uslovima stimulisane proliferacije u odnosu na kontrolu potvrda je efekta alkalizacije koja se javlja u uslovima proliferacije tkiva.
Sigurno je da hipericin povećava citotoksičnost velikog broja citostatika, ali to dejstvo je tkivno specifično, tj. ne može se objasniti jedinstvenim mehanizmom. U prilog tome govore i istraživanja Vinay i saradnika (2006.) koja su opravdala korišćenje hipericina kao adjuvatne terapije sa temozolamidom u terapiji glioblastoma [23]. Hipericin svoje dejstvo ostvaruje inhibicijom protein kinaze C. Tumorska regresija na životinjskom modelu na tretmanu temozolamid i hipericin rezultat je dramatične redukcije ekspresije Bcl-2 i u isto vreme značajne in-dukcije apoptoze. Sva navedena dejstva hipericina potvrđena su u uslovima bez fotostimulacije [23].
Brojna istraživanja govore u prilog primene Hipericin posredovane fotodinamske terapije kao potencijalni tretman malignih ali i nemalignih bolesti (virusnih, gljivičnih, inflamatornih). Tako su Wang i saradnici potvrdili da hipericin fotodinamska terapija (HY PDT) inhibira rast humanih nazocelularnih kancerskih ćelija CNE-2 i indukuje apoptozu istih. Mehanizam kojim HY PDT deluje na celularnom nivou jeste povećanje broja ćelija u S i G fazi ćelijskog ciklusa, što je u korelaciji sa uticajem na DNK sintezu i replikaciju [24]. Isti autori su potvrdili da HY PDT izaziva smrt CNE-2 ćelija putem kaspaza zavisne apoptoze, i to na nivou mitohondrija (intrising signal), ali i kao extrising signalni put koji podrazumeva TNF and FAS-ligand zavisni put [24].
Antiproliferativno, tj. citotoksično, dejstvo hiperi-cina potvrđeno je i u uslovima kada on nije fotostimulisan. Ovakav efekat hipericina moguće je objasniti postojanjem slobodnog elektrona koji se ponaša dvojako, kao akceptor ili donator. Otuda i sam hipericin može da ima dvojni oksidativni efekat, da deluje kao prooksidans ili antioksidans. Takođe je potvrđeno da je oksidativni efekat hipericina funkcija njegove koncentracije, tj. aplikovane doze [25].
Metodom hemiluminiscence dokazano je da je hipericin antioksidans, tj. da inhibira stvaranje slobodnih radikala [26] i deluje inhibitorno na aktivnost glutation reduktaze [27]. Johnson i Pardini (1998.) su ukazali na oštećenje mitohondrija kao kritični momenat za ispoljavanje fototoksičnosti hipericina [27]. U prilog ovom stavu govori značajan porast aktivnosti enzima oksidativnog statusa CuZn SOD, Mn SOD i katalaze posle fotoaktivacije hipericina, a koji se oslobađaju iz oštećenih mitohondrija. Inhibicija glutation reduktaze, tj. izmena gluatation pula koja pomaže citotoksičnost je još jedan mehanizam kojim se mogu objasniti antiproliferativna svojstva hipericina i značaj kiseonika u ispoljavanju njegovih fototoksičnih efekata [27].

ZAKLJUČAK

Hipericin je fotosenzitivno, liposolubilno diantronsko jedinjenje koje se nalazi u kantarionu (Hypericum perforatum), dobro je proučen sa aspekta hemiijskih karakteristika, ali su dosta proučavana i njegova farmakološka svojstva i kli-nička primena. Farmakološka dejstva hipericina uključuju antidepresivno, antivirusno i baktericidno dejstvo, odavno su poznata i primenjena u tradicionalnoj narodnoj medicini.
Brojna istraživanja na ćelijskim linijama in vitro potvrdila su i dala značajno mesto hipericina u fotodinamskoj terapiji različitih tumora (HY PDT). Još uvek mehanizam antitumorskog dejstva hi-pericina nije dovoljno razjašnjen, ali se sigurnošću može tvrditi da je jedan od mehanizama tumorske regresije indukcija apoptoze. Modulatorni efekat hipericina na ćelijsku proliferaciju rezultat je kompleksnih biohemijskih reakcija i ostvaruje se kroz nekoliko mehanizama koji uključuju inhibiciju protein kinaze C, supresije Bcl-2 ekspresije i dvoji oksi-dativni status koji omogućava njegovo dejstvo kao antioksidans ili prooksidans.

LITERATURA

1. Okpanyi SN, Weischer ML. Experimental animal studies of the psychotropic activity of a hypericin extract. Arzneimit-telforschung 1987; 37(1):10-13.
2. Suzuki V, Katsumata Y, Oya M, Bladt S, Wagner H. Inhibition of monoamine oxidase by hypericin. Planta Med 1984; 50(3):272-274.
3. McGovan J, Strain A, Buchler N. DNA synthesis in primary cultures of adult rat hepatocytes in a defined medium: Effect of epidermal growth factor, insulin, glucagon and cyclic- AMP. J Cell Physol 1981; 108(3):353-363.
4. Baskić D, Acimović Lj, Djurdjević P, Djukić A, Arsenijević N. Apoptosis, the programmed cell death. Medicus 2002; 3(2):22-25.
5. Djuričić B, Bumbasirević V. Programmed cell death. Jugoslav Phisol Pharmacol Acta 1994; 30:169-187.
6. Hetts S. To die or not to die. Jama 1998; 279:300-7.
7. Thomson BC. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of diseses. Science 1995; 267:1456-1462.
8. Revvilard JP, Adorini L, Goldman M, Kabelitz D, Waldmann H. Apoptosis: Potential for diseases therapies. Immunology Today 1998; 19(7):291-293.
9. Wiliams GT, Smith CA. Molecular regulation of apoptosis: Genetic controls of cell death. Cell 1992; 74:777-779.
10. Driscoll M, Chalfie M. Developmental and abnormal cell death in C. Elegans. Trends Neurosci 1992; 15:15-19.
11. Vaux DL. Ced-4 the third horseman of apoptosis. Cell 1997; 90(3);389-390.
12. Rabizadeh S, LaCount DJ, Frensen PD, Bredsen DE. Expesion of the bacylovirus P53 gene inhibits mammalian neural cell death. J Neurochem 1993; 61:2318-2321.
13. Mitchell A. Apoptosis: Death trial. Nature Reviews Molecular Cell Biology 2002; 3:81.
14. Kocić G, Pavlović D, Đorđević V, Bjelakovic G, Stojanović I. Role of nitric oxide and peroxynitrite in apoptosis-realtion to endonuclease activity. Jugoslovenska Medicinska Biohemija 2003; 22(2):93-100.
15. Weller M, Trepel M, Grimmel C, Schabet M, Bremen D, Krajewski S et al. Hypericin induced apoptosis of human malignant glioma cells is light-dependent, independent of cl-2 expression and does not require wild-type p53. Neurol Res 1997; 19(5):459-470.
16. Ugwu F, Vandenbogaerde AL, Merlevede WJ, de Witte PA. A comparative study on photocitotoxicity of hypericin on A431 cells using three different assays. Anticancer Res 1998; 18(2A):1181-1184.
17. Vandenbogaerde AL, Cuveele JF, Proot P, Himpens BE, Merlevede WJ, de Witte PA. Different cytotoxiceffects induced after photosenzitation by hypericin. J Photochem Photobiol B 1997; 38(2-3):136-142.
18. Weiss RF. Lenbuch der Phytotherapie. Studgart; 1985.
19. Chen B, Xu Y, Roskams T, Delaey E, Agostinis P, Vandenheede JR et al. Efficacy of antitumoral photodinamic therapy with hypericin: relationship between biodistribution and photodinamic effect in the RIF-1 mouse tumor model. Int J Cancer 2001; 93(2):275-282.
20. Fox F, Niu Z, Tobia A, Rook A. Photoactivated hypericin ia an antiproloferative agent that induces a high rate of apoptotic death of normal, transformed and malignant T lymphocites: implications for the treatment of cutaneous lymphoproliferative and inflamatory disordes. J Invest Dermatol 1998; 111(2):327-332.
21. Hamilton HB, Hinton DR, Law RE, Gopalakrishna R, Su YZ, Chen ZH et al. Inhibition of cellular growth and induction of apoptosis in pituitary adenoma cell lines by the protein kinase C inhibitor hypericin: potential therapeutical application. J Neurosurg 1996; 85(2):329-334.
22. Sokolović T. Modulatorni efekti Biosenzal-a na ćelijsku proliferaciju i imunu funkciju. Medical Faculty University of Nis; 2003.
23. Gupta V, Yuzhuang S, Wang V, Kardosh A, Liebes L, Hofman F et al. Enhacement of Glioblastoma Cell Killing by Combination Treatment with Temozolamide and Tamoxifen or Hypericin. Neurosurg Focus 2006; 20(4):E20.
24. Xiaoli Wang et al. Cellular and Molecular Mechanisms of Photodynamic Hypericin Therapy for Nasopharyngeal Carcinoma Cells. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 2010; 334:847-853.
25. Blank M, Mandel M, Hazen S, Keisari Y, Lavie G. Anti-cancer activities of hypericin an the dark. Photochem Photobiol 2001; 74(2):120-125.
26. Hunt EJ, Lester CE, Lester EA, Tackett RL. Effect of St John’s Wort on free radical production. Life Sci 2001; 69(2):181-190.
27. Johnson SA, Pardini RS. Antioxidant enzyme response to hypericin in EMT6 mouse mammary carcinoma cells. Free Radic Biol med 1998; 24(5):817-826.